2025版中國藥典0722維生素D測定法內容介紹

更新時間：2025-12-18 | 點擊率：15

0722　維生素D測定法

本法系用高效液相色譜法（通則0512）測定維生素D（包括維生素D2和維生素D3，下同）及其制劑、維生素AD制劑或魚肝油中所含維生素D及前維生素D經折算成維生素D的總量，以單位表示，每單位相當于維生素D 0.025μg。

測定應在半暗室中及避免氧化的情況下進行。

無維生素A醇和其他成分干擾的供試品可用第一法測定，否則應按第二法處理后測定；如果按第二法處理后，前維生素D峰仍受雜質干擾，僅有維生素D峰可以分離時，則應按第三法測定；存在維生素A醇和其他成分干擾的供試品也可按第四法測定。

第一法

對照品貯備溶液的制備　根據供試品中所含維生素D的成分，取相應的維生素D2或D3對照品約25mg，精密稱定，置100ml棕色量瓶中，加異辛烷80ml，避免加熱，超聲處理1分鐘使完quan溶解，用異辛烷稀釋至刻度，搖勻，充氮密塞，避光，0℃以下保存，作為貯備溶液（1）；精密量取5ml，置50ml棕色量瓶中，用異辛烷稀釋至刻度，搖勻，充氮密塞，避光，0℃以下保存，作為貯備溶液（2）。

測定維生素D2時，應另取維生素D3對照品25mg，同法制成維生素D3對照品貯備溶液，供系統適用性試驗用。

色譜條件與系統適用性試驗　用硅膠為填充劑；以正己烷-正戊醇（997∶3）為流動相；檢測波長為265nm。量取維生素D3對照品貯備溶液（1）5ml，置具塞玻璃容器中，通氮后密塞，置90℃水浴中加熱1小時，取出，迅速冷卻，加正己烷5ml，搖勻，置1cm具塞石英吸收池中，在2支8W主波長分別為254nm和365nm的紫外光燈下，將石英吸收池斜放成45°并距燈管5～6cm，照射5分鐘，使溶液中含有前維生素D3、反式維生素D3、維生素D3和速甾醇D3；量取該溶液10μl注入液相色譜儀，進樣5次，記錄峰面積，維生素D3峰的相對標準偏差應不大于2.0%；前維生素D3峰（與維生素D3峰相對保留時間約為0.5）與反式維生素D3峰（與維生素D3峰相對保留時間約為0.6）以及維生素D3峰與速甾醇D3峰（與維生素D3峰相對保留時間約為1.1）之間的分離度均應大于1.0。

供試品溶液的制備　取該品種項下制備的供試品溶液。

對照品溶液的制備　精密量取對照品貯備溶液（1）或貯備溶液（2）5ml，置50ml棕色量瓶中，用正己烷稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

測定法　精密量取對照品溶液與供試品溶液各50～200μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按外標法，以峰面積，照下列公式計算維生素D及前維生素D折算成維生素D的總量（ci）。

ci=（c1/A1）·（Ai1+F·Ai2）

式中　c1為對照品溶液的濃度，μg/ml；

A1為對照品溶液色譜圖中維生素D峰的峰面積；

Ai1為供試品溶液色譜圖中維生素D峰的峰面積；

Ai2為供試品溶液色譜圖中前維生素D峰的峰面積；

F為前維生素D相對于維生素D的校正因子，以2.25計；如各論項下檢測波長為254nm，F值為2.05。

第二法

供試品溶液A的制備　取供試品適量（相當于維生素D總量600單位以上，重量不超過2.0g），精密稱定，置皂化瓶中，加乙醇30ml、維生素C 0.2g與50%氫氧化鉀溶液3ml[若供試量為3g，則加50%氫氧化鉀溶液4ml]，置水浴上加熱回流30分鐘，冷卻后，自冷凝管頂端加水10ml沖洗冷凝管內壁，將皂化液移至分液漏斗中，皂化瓶用水60～100ml分數次洗滌，洗液并入分液漏斗中，用不含過氧化物的乙mi振搖提取3次，第一次60ml，以后每次40ml，合并乙mi液，用水洗滌數次，每次約100ml，洗滌時應緩緩旋動，避免乳化，直至水層遇酚酞指示液不再顯紅色，靜置，分取乙mi提取液，加入干燥濾紙條少許振搖除去乙mi提取液中殘留的水分，分液漏斗及濾紙條再用少量乙mi洗滌，洗液與提取液合并，置具塞圓底燒瓶中，在水浴上低溫蒸發至約5ml，再用氮氣流吹干，迅速精密加入甲醇3ml，密塞，超聲處理助溶后，移入離心管中，離心，取上清液作為供試品溶液A。

凈化用色譜系統分離收集維生素D　精密量取上述供試品溶液A 500μl，注入以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的液相色譜柱，以甲醇-乙腈-水（50∶50∶2）為流動相進行分離，檢測波長265nm，記錄色譜圖，維生素D與前維生素D應為重疊峰，并能與維生素A及其他雜質分開。準確收集含有維生素D及前維生素D混合物的全部流出液，置具塞圓底燒瓶中，用氮氣流迅速吹干，精密加入正己烷溶液適量，使每1ml中含維生素D 50～140單位，密塞，超聲處理使溶解，即得供試品溶液B。

對照品溶液的制備　精密量取第一法的對照品貯備溶液（2）5ml，置50ml棕色量瓶中，用正己烷稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

測定法　精密量取對照品溶液與供試品溶液B各100～200μl，照第一法進行含量測定。

第三法

供試品溶液的制備　取該品種項下制備的供試品溶液A，按上述第二法凈化用色譜系統分離收集維生素D項下的方法處理，至“用氮氣流迅速吹干"后，加入異辛烷2ml溶解，通氮排除空氣后，密塞，置90℃水浴中，加熱1.5小時后，立即通氮在2分鐘內吹干，迅速精密加入正己烷2ml，溶解后，即得供試品溶液C。

對照品溶液的制備　精密量取第一法的對照品貯備溶液（1）適量，加異辛烷定量稀釋制成每1ml中約含維生素D 50單位的溶液，精密量取2ml，置具塞圓底燒瓶中，照供試品溶液制備項下的方法，自“通氮排除空氣后"起，依法操作，即得對照品溶液。

測定法　照第一法項下的色譜條件，精密量取對照品溶液與供試品溶液C各200μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算維生素D的含量。

第四法

供試品溶液的制備　取供試品適量（相當于維生素D總量500單位），精密稱定，置25ml棕色量瓶中，加正己烷溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

對照品溶液的制備　精密量取第一法的對照品貯備溶液（1）5ml，置50ml棕色量瓶中，用正己烷稀釋至刻度，搖勻，精密量取2ml，置100ml棕色量瓶中，用正己烷稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

定位溶液的制備　量取第一法的對照品貯備溶液（1）5ml，置50ml棕色量瓶中，加2，6-二叔丁基對甲酚結晶1粒，通氮排除空氣后，密塞，置90℃水浴中加熱1.5小時，取出，迅速冷卻，用正己烷稀釋至刻度，搖勻，作為定位貯備溶液；取定位貯備溶液2ml，置100ml棕色量瓶中，用正己烷稀釋至刻度，搖勻，作為前維生素D峰和維生素D峰定位溶液。

系統適用性溶液的制備　量取上述定位貯備溶液和供試品溶液各5ml混勻，作為系統適用性溶液。

色譜條件與系統適用性試驗　檢測波長265nm，柱溫40℃，流速為每分鐘0.5ml。收集管為聚醚醚酮（Peek）管，內徑0.0762cm（0.03英寸），20m，容積約9ml。

第一維液相色譜：以脲基鍵合硅膠為填充劑（Urea group, 2.1mm×150mm, 3μm，或其功能類似填料的色譜柱）；以正己烷為流動相A，以正己烷-正戊醇-異丙醇（98∶1∶1）為流動相B，按下表程序進行梯度洗脫。

第二維液相色譜：以硅膠（3mm×100mm, 1.8μm）為填充劑；以正己烷-正戊醇-異丙醇（996∶2∶2）為流動相。

量取定位溶液100μl注入第一維液相色譜儀，對前維生素D峰和維生素D峰進行定位。調節第一維液相色譜流動相A和流動相B的初始比例使維生素D主峰的保留時間約25分鐘，第一維液相色譜中前維生素D切換時間設為前維生素D峰保留時間的前后各約1.5分鐘；第一維液相色譜中維生素D切換時間設為維生素D出峰開始時間前和出峰完畢時間后各約1.5分鐘；量取系統適用性溶液100μl注入液相色譜儀，第一維液相色譜系統中前維生素D峰與維生素D峰之間的分離度應不小于5，理論板數按維生素D峰計算應不低于2300；第二維液相色譜系統中維生素D峰與相鄰峰之間的分離度以及前維生素D峰與相鄰峰之間的分離度均應符合規定。

測定法　精密量取對照品溶液與供試品溶液各100μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按第一法的計算方法計算，即得。

【附注】高效液相色譜儀需要雙泵、雙通道、雙紫外檢測器。一般情況下選用六通閥即可完成方法的切換過程，六通閥連接如圖1所示。

圖1　六通閥連接圖

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